جهت گيرى سيتوزولى پراكسيزومال پروتئين موشى فاقد ترى پپتيد SKI متصل به پروتئين سبز فلورسنت در سلول هاى K1-CHO و P19

مريم استاد شريف، كامران قائدى، محمدحسين نصر اصفهانی، سميه تنهايى، خديجه كربلايى، كاظم پريور، حسين بهاروند

چکیده

هدف: آناليز اسيد آمينه اى ژن پراكسيزومال پروتئين نشان مى دهد كه در انتهاى كربوكسيل در اين سازه قلمرو SKI وجود دارد. به منظور يافتن اهميت اين بخش، از طريق ايجاد موتاسيون هدفدار ترس پپتيد SKI حذف گرديد و در سلولهاى K1-CHO و P19 ترانسفكت گرديد.

مواد و روش ها: به منظور ايجاد سازه جهش يافته مورد نظر PCR با استفاده از پرايمرهاى مناسب صورت گرفت. موتانت حاصل در فرودست ژن EGFP تحت كنترل پروموتر CMV قرارداشت. پس از تعيين توالى با كمك ليپوفكتامين 2000 به درون سلول هاى K1-CHO و P19 ترانسفكت گرديد.

یافته ها: گراديان دمايى PCR نشان مى دهد كه بهترين دماى اتصال، 6/71 درجه است. ترانسفكت نمودن PeP-EGFP الگوى سبز رنگ نقطه دار دارد، در حالى كه سازه ΔSKI/PeP-EGFP پس از ترانسفكت نمودن الگوى يكنواخت سبزرنگ دارد.

نتيجه گيری: با توجه به نتايج به دست آمده مشخص مى شود كه SKI در انتهاى كربوكسيل پروتئين براى ورود به پراكسيزوم لازم و ضرورى است.

كليدواژگان: پپتيدنشانه، پراكسيزومال پروتئين، سيگنال هدفيابی

Cytosolic Localization of Mouse Peroxisomal Protein/∆SKI Fused with Enhanced Green Fluorescent Protein into Chinese Hamster Ovary-K1 and P19 Cells

Maryam Ostadsharif, Kamran Ghaedi, Mohammad Hossein Nasr Esfahani, Somayeh Tanhaie, Khadijeh Karbalaii, Kazem Parivar, Hossein Baharvand

Abstract

Objective: Amino acid alignment analysis of deduced amino acid residues revealed a tripeptide (SKI) at the carboxy terminus of peroxisomal protein cDNA. In order to see the importance of the above sorting signal, we have performed a site-directed mutagenesis to delete SKI tripeptide and its transfection into CHO-K1 and P19 cells.

Materials and Methods: In order to create the appropriate site-directed mutant, PCR was done with specific primers. Amplified PeP cDNAs either containing SKI or deleted ones were constructed downstream of EGFP cDNA under regulation of the cytomegalovirus (CMV) promoter in a pEGFP-C1 vector. Transfection of P19 and CHO cells was done with lipofectamine2000.

Results: Gradient PCR showed that the best annealing temperature was 71.6 ºC. Transfection of plasmids containing chimera of EGFP-PEP cDNAs into the CHO-K1 and P19 cells showed several punctuate structures, presumably peroxisomes, while SKI deletion showed a cytosolic mislocalization of the EGFP pattern.

Conclusion: Taken together, these data strongly suggest that SKI, which is located at the C- terminus of the protein, is required for sorting this protein.

Keywords: Peroxisomal Protein, Peroxisome Targeting, Signal Peptide