كلونينگ cDNA پروتئين پراكسيزومی موش و بررسى جاىگيرى درون سلولى آن

مريم استاد شريف، شهناز رضوى، خديجه كربلايى، كامران قائدى، مليحه نظرى جهان تيغ، حسين بهاروند، مرضيه نعمت اللهى، فرزانه ربيعى

چکیده

هدف: كلون نمودن cDNA پروتئين پراكسيزومی در پلاسميد يوكاريوتی بيانی C1-EGFP و بررسی الگوی بيان ژن PEP) Protein Peroxisomal (متصل به ماركرپروتئين سبز فلورسانس در سلول تخمدان خوكچه هندی

مواد و روش ها: پس ازاستخراج RNA كل سلول ازقلب موش بالغ، cDNA مربوطه تهيه شد و با استفاده ازپرايمرهای اختصاصی تكثير cDNA PEP صورت گرفت. cDNA PEP تكثير شده پس از هضم آنزيمی در پلاسميد C1-EGFP قرار گرفت. باكتري هاى 10 TOP Shot One با محصول اتصال پلاسميد و cDNA PEP ترانس فورم گرديد و پس ازكشت كلونی های مثبت دارای پلاسميد نو تركيب با آزمون PCR انتخاب و تكثير گرديدند و بر روي پلاسميد خالص شده از آن ها تست های هضم آنزيمی و تعيين توالی انجام شد. برای بررسی الگوی بيان PEP درون سلول هاى CHO، اين سلول ها با 4 ميگروگرم پلاسميد و 10 ميكروليتر ليپوفكتامين 2000 ترانسفكت شدند.

يافته ها: نتايج هضم آنزيمی و تعيين توالی ثابت كرد كه قطعه تكثير و كلون شده همان cDNA PEP مى باشد. اين cDNA 630 جفتبازى كدكننده 209 اسيدآمينه است كه بررسى هاى بيوانفورماتيكى نشان دهنده وجود يك دامنه فيبرونكتين نوع 3 از اسيدآمينه 31 تا 114 و با احتمال بسيار زياد دو دامنه آلفاهليكس درون غشايى آبگريز از اسيد آمينه 12 تا 32 و 152 تا 169 در آن مى باشد. نتايج ترانسفكشن سلولى به همراه رنگآميزى اختصاصى كاتالاز ثابت مى كند كه اين پروتئين با سيگنال انتهاى كربوكسيل خود، (SKL; Lucine Lysine Serine)، به درون اندامك پراكسيزوم منتقل می شود.

نتيجه گيری: مطالعات اثبات مى كند كه PEP يك پروتئين پراكسيزومى است؛ هرچند اين پروتئين يك دامنه فيبرونكتين نوع 3 و دو دامنه آبگريز دارد كه نقش آن ها هنوز نامشخص است.

كليدواژگان: فيبرونكتين، پراكسيزوم، سيگنال PTS1

Mouse Peroxisomal Protein cDNA Cloning and Characterization of its Intraclleular Localization

Somayeh Tanhaie, Kamran Ghaedi, Khadijeh Karbalaii, Shanaz Razavi, Maryam Ostadsharif, Maliheh Nazari-Jahantigh, Farzaneh Rabeei, Marziyeh Nematollahi, Hossein Baharvand, Mohammad Hossein Nasr Esfahani

Abstract

Objective: The aim of this study was to clone peroxisomal protein (PEP) cDNA in a mammalian expression vector in a chimeric cDNA type, with enhanced green fluorescent protein (EGFP) cDNA. To investigate the intracellular localization of PEP protein linked to EGFP marker, the constructed plasmid was used for transfection into the chinese hamster ovary (CHO) cells.

Materials and Methods: Total RNA was extracted from the heart tissue of an adult mouse. PEP cDNA was constructed using reverse transcriptase and was amplified with specific primers covering the entire length of ORF. RT-PCR products containing PEP cDNA were treated by enzymatic digestion and inserted into the pEGFP-C1 downstream of EGFP cDNA and were used for transformation into bacterial competent cells. The positive colonies which showed inserted PEP cDNA were selected for plasmid preparations and additional analysis was performed to ensure that PEP cDNA was inserted properly. Finally, to confirm the intracellular localization of EGFP-PEP, CHO cells were transfected with the constructed plasmid.

Results: Our results confirmed amplification and cloning of the expected product. PEP cDNA encompasses 630 bp which encodes 209 amino acid residues. Bioinformatics analyses have shown the presence of a fibronectin type III domain (31-114 a.a.) and two hydrophobic domains (12-32 a.a. and 152-169 a.a., respectively). Because of the presence of serine, Lysine, leucine (SKI) in the C-terminal of the related protein, transfection data showed peroxisomal localization of PEP as was similar to the catalase.

Conclusion: Taken together these data showed that PEP is a peroxisomal protein. However the importance of its fibronectin type III and two hydrophobic domains should be assessed by further experiments.

Keywords: Fibronectin, Peroxisome, Peroxisome Targeting Signal 1